Мощные электрические поля обладают способностью образовывать поры в биологических мембранах посредством процесса, называемого электропорацией. Преднамеренное создание этих дефектов в мембранах является важнейшим методом не только в медицине и биотехнологии, но и при обработке пищевых продуктов.
Франко-немецкая исследовательская группа, возглавляемая доктором Карлосом Маркесом из Высшей нормальной школы в Лионе, Франция, и профессором доктором Яном Берендсом из Института физиологии Фрайбургского университета, недавно собрала данные, которые ставят под сомнение то, что десятилетиями считалось стандартной моделью этого механизма.
“Это вызов для построения теории и численного моделирования в этой области”, - говорит Маркес. Результаты теперь опубликованы в Трудах Академии наук Соединенных Штатов Америки (PNAS). Они могут помочь улучшить транспорт активных веществ в клетках.
Терапевтические вещества попадают в клетки через электропоры
Электрические поля постоянного тока выше определенной интенсивности нарушают организацию липидов, жироподобных молекул, которые образуют основную структуру биологических мембран в бислое, уложенных вместе в виде жидкого кристалла. Образующиеся электропоры, которые обычно стабильны только в течение очень короткого времени, позволяют воде и растворенным веществам из окружающей среды, таким как лекарства или другие активные вещества, включая РНК или ДНК, проникать в клетку.
Поскольку бислой липидов очень тонкий, размером всего в пять миллионных долей миллиметра, нет необходимости применять очень высокие напряжения для создания очень высокой напряженности поля (вольт на метр). Таким образом, даже при напряжении 0,1 вольта на мембране напряженность поля составляет 20 миллионов вольт на метр. Например, в воздухе искровой разряд уже происходит при трех миллионах вольт на метр. Однако это должно быть напряжение постоянного тока; поля переменного тока в диапазоне мегагерц-гигагерц, такие как те, которые генерируются сотовыми телефонами, не вызывают пор. Хотя метод хорошо зарекомендовал себя, все еще существует необходимость оптимизировать электропорацию клеточных мембран для различных целей, таких как введение генетического материала для генной терапии. Для этого важно точно понять механизм образования пор под действием электрических полей.
Стандартная модель с небольшой экспериментальной проверкой
Стандартная теоретическая модель электропорации 1970-х годов предполагает, что электрическое поле оказывает давление на липиды, тем самым увеличивая вероятность образования пор. Однако пока существует лишь небольшая экспериментальная проверка модели. Это связано, во-первых, с трудностью прямого обнаружения образования электропор и, во-вторых, с необходимостью проведения очень большого количества таких экспериментов для получения статистически обоснованных выводов. Это связано с тем, что, в отличие от пор, образованных белками, электропоры проявляют очень разнообразное, менее стереотипное поведение.
Методом, который способен обнаруживать образование пор с большой точностью и высоким временным разрешением, является электрическое измерение ионного тока. Ионы являются положительно или отрицательно заряженными составляющими солей, присутствующих во всех биологических жидкостях и, следовательно, внутри и снаружи клетки. Они практически не способны проникать через неповрежденные мембраны, но как только поры открываются, они переносятся через них в электрическом поле. Этот перенос заряженных частиц можно измерить с помощью высокочувствительных усилителей в виде крошечного электрического тока от нескольких миллиардных до миллионных долей ампера. Для этой цели искусственные липидные бислои создаются в тонких слоях тефлона через крошечные отверстия диаметром около 0,1 миллиметра и помещаются между двумя электродами. Этот метод формирования мембран очень подвержен разрушению - за раз формируется только одна мембрана, которая легко разрушается, особенно во время испытаний с более высоким напряжением.
Новый метод создания липидных слоев
Для своих экспериментов исследовательская группа использовала микрочип со множеством отверстий, с помощью которого можно очень быстро и многократно создавать значительно более стабильные липидные слои, используя упрощенные процедуры. Эта так называемая матрица микроэлектродных резонаторов (MECA) была разработана исследовательской группой Яна Берендса и была произведена и коммерчески доступна фрайбургской стартап-компанией Ionera Technologies GmbH, основанной в 2014 году.
С помощью этого устройства докторант Элали Лафарж из Института Шарля Садрона при Страсбургском университете и доктор Екатерина Зайцева из исследовательской группы Фрайбурга смогли создать сотни мембран за относительно короткое время, а также измерить и количественно оценить образование пор в зависимости от прочности материала.поле постоянного тока.
Результаты показали, что, вопреки предсказанию старой стандартной модели, энергетический барьер для образования пор уменьшается не с квадратом напряженности поля, а пропорционально напряженности поля. Другими словами, удвоение напряженности поля снижает энергетический барьер только наполовину, а не в четыре раза. Это предполагает принципиально иной механизм: дестабилизацию границы раздела между липидом и водой из-за переориентации молекул воды в электрическом поле.
Окисленные мембраны также изучались
Этот результат был также подтвержден для мембран, липиды которых были окислены в разной степени. Это интересно, потому что окисление липидов является естественным процессом регуляции функции клеточных мембран и играет роль в естественном старении организма и, возможно, также при таких заболеваниях, как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера. “Особенно учитывая медицинскую значимость этой темы, мы хотим продолжить ее изучение, включая оптические методы, чтобы достичь реального понимания этого важного явления”, - говорит Берендс.
Ссылка: “Энергия активации для открытия пор в липидных мембранах под действием электрического поля” Элали Дж. Лафарж, Пьер Мюллер, Андре П. Шредер, Екатерина Зайцева, Ян К. Берендс и Карлос М. Маркес, 7 марта 2023 года, Труды Национальной академии наук.
DOI: 10.1073 / pnas.221311220